RÉSOLUTION OENO 8/2008

CODEX - CELLULASES

L’ASSEMBLEE GENERALE

VU l’Article 2, paragraphe 2 iv de l'accord du 3 avril 2001 portant création de l'Organisation internationale de la vigne et du vin,

SUR PROPOSITION de la Sous-Commission des méthodes d’analyse  et du groupe d’experts « Spécifications des produits œnologiques »

DECIDE de compléter le Codex Œnologique international par la monographie suivante :

CELLULASES

(endo-(14)--D-glucanase)

(EC 3.2.1.4 – CAS n° 9012-54-8)

Spécifications générales

Ces enzymes ne sont pas trouvées à l’état pur mais elles sont présentes au sein d’un complexe enzymatique. Sauf indications contraires, les spécifications doivent être conformes à la résolution Oeno 14/2003 concernant les spécifications générales pour les préparations enzymatiques qui figurent dans le Codex œnologique international.

1.      Origine et application

Les enzymes catalysant la dégradation des polysaccharides de type cellulose des parois cellulaires de la baie de raisin  dont les  bêta glucanases (ici on parle de l’endo-(14)-β-D-glucanase) sont utilisées pour la clarification des vins, pour améliorer la filtrabilité des moûts et des vins, et pour augmenter les phénomènes de diffusion au cours de la macération.

Les préparations enzymatiques contenant cette activité proviennent de fermentations dirigées d’Aspergillus niger et/ou de mélange Aspergillus niger – Trichoderma reesei

Activités secondaires : protéases, bêta-glucosidases. Dans le cas présent la clause des 50% peut s’appliquer (résolution oeno 14/2003 4.1)

2.      Domaine d’application

La méthode de dosage a été mise au point à l’aide d’une glucanase commercialisée (5.4.). Les conditions et la méthode ont été développées pour l’application aux préparations enzymatiques du commerce telles que retrouvées sur le marché œnologique.

3.      Principe

L’endo-(14)--D-glucanase catalyse l’hydrolyse de façon aléatoire des liaisons osidiques au sein de la cellulose. Son activité peut donc être appréciée en dosant les sucres réducteurs (exprimés en glucose), libérés lors de l’incubation, par la méthode de NELSON (1944).

On ne mesure que les activités de types « endo- » du fait de la présence de groupements carboxyméthyles qui bloquent l’action des exo-glucanases. Les endo-glucanases agissent à l’intérieur des chaînes dans les zones non carboxyméthylées. En milieu alcalin, le groupement pseudoaldéhydique des sucres réduit les ions cuivriques Cu²⁺. Ces derniers réagissent avec le réactif arséniomolybdique en donnant une coloration bleue dont l’absorbance, mesurée à 520 nm, varie de manière linéaire avec la concentration en oses (entre 0 et 250 g/mL).

4.      Appareillage

4.1. Agitateur magnétique chauffant

4.2. Bain d'eau à 40°C

4.3. Bain d'eau à 100°C

4.4. Vase cylindrique de 100 mL

4.5. Centrifugeuse pouvant recevoir des tubes en verre de 15 mL

4.6. Chronomètre

4.7. Fiole jaugée de 100 mL

4.7.1. Fiole jaugée de 500 mL

4.8. Seringue de précision 200 µl

4.8.1. Seringue de précision 1 mL

4.9. Pipette droite de 10 mL graduée au 1/10^e de mL

4.10. Spectrophotomètre

4.11. Tubes en verre de 15 mL

4.12. Agitateur de type vortex

4.13. Flacon en verre brun de 500 mL.

4.14. Chambre à 4°C

4.15. Etuve à 37°C

4.16. Coton cardé

4.17. Papier Kraft

4.18. pH mètre

4.19. Portoir métallique pour tubes de 15 mL

4.20. Cuves de 1 cm de parcours optique, à usage unique, pour spectrophotomètre, pour mesure dans le visible

4.21. Sonde à ultra-son

5.      Produits

5.1. Acétate de sodium (CH₃COONa pur à 99% - PM = 82 g/mole)

5.2. Acide acétique (CH₃COOH pur à 96% - PM = 60 g/mole, densité = 1,058)

5.3. Carboxyméthylcellulose (CMC) ayant un degré de substitution de 65 à 95%.

5.4. Cellulase de Trichoderma reesei (Fluka, 4U/mg, réf : 22173) à titre d’exemple. Une unité, libère 1 mole de glucose provenant de la carboxyméthylcellulose par minute.

5.5. Sulfate de sodium anhydre (Na₂SO₄ pur à 99,5% - PM = 142 g/mole)

5.6. Carbonate de sodium anhydre (Na₂CO₃ pur à 99,5% - PM = 105,99 g/mole)

5.7. Tartrate de potassium et de sodium (KNaC₄H₄O₆.4H₂O pur à 99% - PM = 282,2 g/mole)

5.8. Hydrogénocarbonate de sodium anhydre (NaHCO₃ pur à 98% - PM = 84,01 g/mole)

5.9. Sulfate de cuivre penta-hydraté (CuSO₄.5H₂O pur à 99% - PM = 249,68 g/mole)

5.10. Acide sulfurique (H₂SO₄ pur à 98%) concentré

5.11. Heptamolybdate d’ammonium ((NH₄)₆MO₇O₂₄.4H₂O pur à 99% - PM = 1235,86 g/mole)

5.12. Hydrogénoarséniate de sodium (Na₂HAsO₄.7H₂O pur à 98,5% - PM = 312,02 g/mole). Compte tenu de la toxicité de ce produit, une attention particulière doit être portée lors de sa manipulation. Les déchets doivent être traités de manière appropriée.

5.13. D-glucose anhydre (C₆H₁₂O₆ pur à 99% - PM = 180,16 g/mole)

5.14. Eau distillée

5.15. Préparation enzymatique commerciale à analyser

6.      Solutions

6.1.      Réactifs de la solution oxydante

Ces réactifs devront être préparés en premier, compte-tenu du délai de 24 heures pour la solution D.

6.1.1.     Solution A :

Placer dans un vase cylindrique de 100 mL (4.4) successivement

20 g de sulfate de sodium anhydre (5.5)

2,5 g de carbonate de sodium anhydre (5.6)

2,5 g de tartrate de potassium et de sodium (5.7)

2 g de hydrogénocarbonate de sodium anhydre (5.8)

Dissoudre dans 80 mL d’eau distillée (5.14). Chauffer (4.1) jusqu’à dissolution et transvaser dans une fiole de 100 mL (4.7). Compléter jusqu’au trait de jauge avec de l’eau distillée (5.14).

Conserver à 37 °C (4.15) ; s’il se forme un dépôt : filtrer à l’aide d’un filtre plissé.

6.1.2.     Solution B :

Dissoudre 15 g de sulfate de cuivre hydraté (5.9) dans 100 mL d’eau distillée (5.14) et ajouter une goutte d’acide sulfurique concentré (5.10). Conserver à 4°C.

6.1.3.     Solution C :

Cette solution est préparée extemporanément pour avoir une bonne proportionnalité entre la densité de couleur et la quantité de glucose en mélangeant 1 mL de solution B (6.1.2) avec 24 mL de solution A (6.1.1).

6.1.4.     Solution D :

Dans une fiole jaugée de 500 mL (4.7.1), dissoudre 25 g de molybdate d’ammonium (5.11) dans 400 mL d’eau (5.14). Ajouter 25 mL d’acide sulfurique concentré (5.10) (refroidi sous courant d’eau froide).

Dans un vase cylindrique de 100 mL (4.4) dissoudre 3 g d’arséniate  de sodium (5.12) dans 25 mL d’eau (5.14) et transvaser quantitativement dans la fiole jaugée de 500 mL (4.7.1) contenant le molybdate d’ammonium (5.11).

Compléter avec de l’eau (5.14) pour avoir un volume final de 500 mL.

Placer à 37°C (4.15) pendant 24 heures puis conserver à 4°C (4.14) dans un flacon en verre brun de 500 mL (4.13).

6.2.      Tampon acétate de sodium (pH 4,2, 100 mM) 

Il est constitué des solutions A et B.

6.2.1.     Solution A :

Acétate de sodium 0,1 M :  dissoudre 0,5 g d’ acétate de sodium (5.1) dans 60 mL d’eau distillée (5.14)

6.2.2.     Solution B :

Acide acétique 0,1 M : étendre 1 mL d’acide acétique (5.2) par 175 mL d’eau distillée (5.14)

6.2.3.     Préparation du Tampon acétate de sodium :

Mélanger 23,9 mL de solution A (6.2.1) + 76,1 mL de solution B (6.2.2).

Vérifier le pH du tampon à l’aide d’un pH mètre (4.18).

La solution doit être conservée à 4°C (4.14).

6.3.      Solution de carboxyméthylcellulose (CMC) à 2% (p/v) à préparer extemporanément

Dans une fiole jaugée de 100 mL (4.7) introduire 2 g de CMC (5.3) dans 100 mL d’eau distillée (5.14)

Compte-tenu de la grande viscosité et afin d’avoir une solution homogène, il faut pouvoir soniquer (4.21), agiter sans chauffer (4.1) et la garder en suspension sous agitation constante.

6.4.      Solution mère de glucose à 250 µg/mL

Dans une fiole jaugée de 100 mL (4.7), dissoudre 0,0250g de glucose (5.13) dans de l’eau distillée (5.14) en complétant à 100 mL.

7.      Préparation de la gamme étalon de glucose

Elle est réalisée à partir de la solution mère de glucose à 250 µg/mL (6.4.), comme indiqué dans le tableau n°1.

Tableau 1 : gamme étalon de glucose à partir de la solution mère

Glucose  (µg/mL)	0	25	50	100	150	200	250
Glucose (µmole/mL)	0	0,139	0,278	0,555	0,833	1,110	1,388
Vol (µl) solution mère (6.4)	0	100	200	400	600	800	1000
Vol (µl) eau distillée (5.14)	1000	900	800	600	400	200	0

8.      Préparation de l’échantillon

Il est important d’homogénéiser la préparation enzymatique avant la prise d’échantillon, par retournement du récipient, par exemple. La solution enzymatique et les blancs devront être préparés au moment de l’utilisation.

8.1.      Solution enzymatique à 2 g/l à préparer extemporanément

Placer 200 mg de préparation commerciale (5.15) dans une fiole jaugée de 100 mL (4.7), compléter avec de l’eau distillée (5.14), agiter afin d’obtenir un mélange homogène.

8.2.      Blanc dénaturé par chauffage à préparer extemporanément

Placer 10 mL de la solution enzymatique à 2 g/l (8.1) dans un tube de 15 mL (4.11), boucher avec du coton cardé (4.16) recouvert de papier Kraft (4.17) et plonger le tube durant 5 minutes dans le bain d'eau à 100°C (4.3). Puis refroidir et centrifuger pendant 5 min à 6 500 g.

9.      Mode opératoire

9.1.      Cinétique enzymatique :

Les tubes sont réalisés en double au minimum.

Dans 5 tubes de 15 mL (4.11) numérotés de 1 à 5, placés dans un portoir (4.19) dans un bain d’eau à 40°C, introduire 

200 µl de la solution enzymatique à 2 g/l (8.1), à l’aide de la seringue de précision (4.8), 400 µl de tampon acétate de sodium (6.2), à l’aide de la seringue de précision (4.8.1),

600 µl de la solution de carboxyméthylcellulose (6.3) préalablement portée à 40°C dans le bain d'eau, enclencher le chronomètre (4.6).

Après agitation (4.12), les tubes bouchés avec du coton cardé (4.16) et du papier Kraft (4.17) sont replacés dans le bain d’eau à 40 °C (4.2)

• Durant 1 mn pour le tube n°1
• Durant 2 mn pour le tube n°2
• Durant 5 mn pour le tube n°3
• Durant 10 mn pour le tube n°4
• Durant 15 mn pour le tube n°5

La réaction est stoppée en plaçant chacun des tubes numérotés de 1 à 5 immédiatement après qu'ils aient été enlevés du bain d'eau à 40°C, dans le bain d’eau à 100°C (4.3) durant 10 mn.

Les tubes sont ensuite refroidis sous courant d’eau froide.

Note : le point de cinétique à 10 min permet d’évaluer l’activité enzymatique recherchée.

9.2.      Dosage des substances réductrices libérées

Dans un tube de 15 mL (4.11)

Placer 1 mL du milieu réactionnel (9.1)

Ajouter 1 mL de solution C (6.1.3)

Après agitation (4.12), le tube est placé dans le bain d’eau à 100°C (4.3) durant 10 mn.

Le tube est ensuite refroidi sous courant d’eau froide.

Ajouter 1 mL de la solution D (6.1.4)

Ajouter 9,5 mL d’eau (5.14) à l’aide de la pipette droite de 10 mL (4.9)

Attendre 10 mn pour la stabilisation de la couleur.

Centrifuger (4.5) chacun des tubes à 2430 g durant 10 mn.

Placer le surnageant dans une cuve (4.20).

Réaliser le zéro du spectrophotomètre avec de l’eau distillée.

Mesurer aussitôt l’absorbance à 520 nm, à l’aide d’un spectrophotomètre (4.10).

9.3.      Blancs

Opérer comme décrit en 9.1 en remplaçant la solution enzymatique à 2 g/l (8.1) par le blanc dénaturé par la chaleur (8.2Pour chaque point de cinétique,  la réaction enzymatique de chaque blanc est réalisée en même temps que celle de la solution enzymatique.

9.4.      Gamme étalon

Opérer comme décrit en 9.2 en remplaçant le milieu réactionnel (9.1) par les différents milieux de la gamme étalon de glucose de 0 à 250µg/mL (7).

10.    Calculs

10.1. Réalisation d’une cinétique

De manière générale, le calcul de l’activité enzymatique ne peut se faire que lorsque le substrat et l’enzyme ne sont pas en quantités limitantes. On se situe alors dans la phase ascendante de la représentation cinétique : l’activité enzymatique est linéaire dans le temps. Dans le cas contraire, l’activité serait sous estimée (Figure 1).

Figure 1 : Cinétique de réaction enzymatique

Une cinétique sur 15 minutes est réalisée. L’activité concernée est mesurée à T=1 min T=2 min, T=5 min, T=10 min, T=15 min.

Après avoir réalisé la cinétique de réaction enzymatique, établir la courbe de variation de l'absorbance en fonction du temps de réaction. L’absorbance correspond à la différence entre l’absorbance à un temps T de la préparation enzymatique et du blanc correspondant.

Puis calculer l'équation (1) de la droite de régression en ne prenant en compte que les points de la phase ascendante (voir figure 1).

10.2. Réalisation de la droite d’étalonnage

La droite d’étalonnage correspond à l’établissement d’un graphique ayant pour abscisse les différentes concentrations de la gamme étalon de glucose (de 0 à 0,693 µmole/mL) et en ordonnée les valeurs de densités optiques correspondantes, obtenues en 9.4. Calculer ensuite la pente (Q/T) de la droite de régression (2) résultant de la linéarité des données du graphique.

10.3. Calcul de l’activité enzymatique

A partir de la droite de régression (1) calculer l'absorbance pour un temps moyen T (par exemple 4 mn pour le cas de la figure 1) en déduire la quantité Q de glucose libéré (en µmoles) pour ce temps intermédiaire à l'aide de l'équation (2).

La formule pour calculer l’activité enzymatique en U/g de préparation est la suivante :

• 

Avec Q : quantité de glucose libéré en µmoles pendant un temps T (min)

V : quantité de solution enzymatique introduite (mL) ici 0,2 mL

C : concentration de la solution enzymatique (g/l) ici 2 g/l

Ensuite, il est possible d’exprimer l’activité enzymatique en nanokatal. Cette unité correspond au nombre de nanomoles de produit formé par seconde dans les conditions définies par les protocoles de dosages et donc :

• 

11.    Caractéristiques de la méthode

r	0,084
R	0,056
Sr	0,03
SR	0,02

La répétabilité intralaboratoire de la méthode est estimée par le biais de la moyenne des écarts-types des valeurs d’absorbance issus d’un même prélèvement de la préparation enzymatique, dosé 5 fois. Ainsi, pour le dosage de la carboxyméthylcellulase, la moyenne des écarts-types des valeurs est de 0,03 avec un pourcentage d’erreur de 13,56. Le % d’erreur correspondant à :

• 

Ainsi, la méthode de dosage telle que présentée est jugée répétable.

Les essais de reproductibilité intralaboratoires ont été effectués à l’aide de 2 préparations enzymatiques et 5 prises d’échantillons pour chacune.

Il a été utilisé 2 tests qui ont permis de déterminer la bonne reproductibilité de la méthode :

• L’analyse de variance (étude de la probabilité d’apparition d’écarts entre les prises d’échantillons). L’analyse de variance est une méthode statistique qui permet de tester l’hypothèse d’homogénéité d’un ensemble de k moyennes. Réaliser l’analyse de variance consiste à rechercher si l’effet « traitement » est « significatif ou non ». Cette analyse de variance donne un écart type de reproductibilité de 0,02.
• La puissance de l’essai au risque  de première espèce (5%) – Le risque  de première espèce est le risque de décider que des traitements effectivement identiques sont différents.

Si la puissance est faible ( 20%), cela veut dire qu’aucune différence n’a été décelée entre les traitements, mais il existe peu de chance de voir une différence s’il en existait une réellement.

Si la puissance est élevée ( 80%), cela veut dire qu’aucune différence n’a été décelée entre les traitements, mais, s’il en existe une, nous avions les moyens de la voir.

Les résultats sont donnés au tableau 2 :

Dosages	Hypothèses de l’analyse de variance	Probabilité	Puissance de l’essai ( = 5%)	Test Newman-Keuls (*)	Test Bonferroni (**)
Endo-(14)--D-glucanase	Respectées	0,00011	95%	Significatif	Significatif

Tableau 2 : Analyse de variance – étude de l’effet prise d’échantillon

* Test Newmann-Keuls : ce test de comparaison de moyennes permet de constituer des groupes homogènes de traitements : ceux appartenant à un même groupe sont considérés comme non différents au risque  de première espèce choisi

** Test de Bonferroni : aussi appelé « test du t corrigé », le test de Bonferroni permet de réaliser toutes les comparaisons 2 à 2 de moyenne, c’est à dire, (t (t-1) )/2 comparaisons avant traitements, en respectant le risque  de première espèce choisi.

Ainsi, les essais mis en place permettent de voir une différence s’il en existe une réellement (puissance de l’essai forte), de plus la méthode de dosage présente une probabilité d’apparition d’écart d’activité (entre prises d’échantillons) inférieure à 5%.

12.    Bibliographie

1. NELSON N., A photometric adaptation of the SOMOGYI method for the determination of glucose. The may Institute for medical research of the Jewish hospital, 1944. p 375-380.
2. Activités enzymatiques et leurs mesures – Document OIV, FV 1226, 2005