Dosage des principaux acides organiques des vins par électrophorèse capillaire

État: En vigueur

Dosage des principaux acides organiques des vins par électrophorèse capillaire

RESOLUTION  OENO 5/2006

DOSAGE DES PRINCIPAUX ACIDES ORGANIQUES DES VINS PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

L’ASSEMBLEE GENERALE

VU l'article 2 paragraphe 2 iv de l'accord du 3 avril 2001 portant création de l'organisation internationale de la vigne et du vin

SUR PROPOSITION de la Sous-Commission des méthodes d’analyse et d’appréciation des vins,

DECIDE: d’introduire dans l’annexe A du Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts la méthode suivante et de l’adopter sous forme de méthode de type III:

Titre

Type de méthode

DOSAGE DES PRINCIPAUX ACIDES ORGANIQUES DES VINS

PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

III

1.      INTRODUCTION

Les acides tartrique, malique et lactique sont séparés et dosés par électrophorèse capillaire après simple dilution et addition d'étalon interne.

2.      TITRE

DOSAGE DES PRINCIPAUX ACIDES ORGANIQUES DES VINS PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

3.      DOMAINE D'APPLICATION

L'électrophorèse capillaire permet de doser les acides tartrique et malique des moûts ainsi que les acides tartrique, malique et lactique des vins préalablement dilués, dégazés et filtrés si besoin.

4.      DEFINITIONS

4.1.      ELECTROPHORESE CAPILLAIRE

L'électrophorèse capillaire : ensemble de techniques qui utilisent un capillaire de silice de très faible diamètre pour séparer efficacement à l'aide d'un tampon approprié, à la fois des petites et des grosses molécules électriquement chargées en présence d'un courant électrique de fort voltage.

4.2.      TAMPON POUR ELECTROPHORESE

Solution contenant un ou plusieurs solvants et des solutés de mobilités électrophorétiques convenables capables de tamponner le pH de cette solution.

4.3.      MOBILITE ELECTROPHORETIQUE

Aptitude d'un ion à se déplacer rapidement sous l'effet  d'un champ électrique.

4.4.      FLUX ELECTROOSMOTIQUE 

Ecoulement du solvant du tampon le long de la paroi interne du capillaire dû aux déplacements des ions solvatés sous les effets du champ et des charges électriques de la silice.

5.      PRINCIPE

Les séparations des solutés d'un mélange par électrophorèse capillaire sont obtenues par migrations différentielles dans un électrolyte tamponné appelé tampon. L'électrophorèse se déroule dans un tube de silice de diamètre intérieur compris entre 25 et 75 µm. Les solutés à séparer sont entraînés simultanément par 2 forces qui  peuvent agir dans le même sens ou en sens contraire. Ces deux forces sont dues au champ électrique et au flux électroosmotique.

Le champ électrique est représenté par la tension en volts appliquée entre les électrodes ramenée à un centimètre de capillaire, il est exprimé en V.cm-1. La mobilité est une caractéristique de l'ion. Plus les molécules sont petites et chargées plus leur mobilité électrophorétique est importante. 

Dans le cas où la paroi interne du capillaire est non revêtue, les charges électriques  négatives de la silice vont engendrer une fixation d'une partie des cations du tampon. La solvatation et le déplacement vers la cathode d'une partie des cations du tampon créent le flux électroosmotique. Les choix du pH du tampon et l'utilisation d'additifs permettent de contrôler le sens et l'intensité de ce  flux électroosmotique.

L'addition d'un ion chromophore dans le tampon permet l'obtention de pics négatifs qui représentent quantitativement les solutés à séparer qui n'absorbent pas à la longueur d'onde utilisée.

6.      REACTIFS ET PRODUITS

6.1.      Produits purs de qualité pure pour analyse  à 99 % au moins

6.1.1. Sulfate de sodium

6.1.2. Acide L-tartrique

6.1.3. Acide D,L-malique

6.1.4. Acide citrique monohydraté

6.1.5. Acide succinique

6.1.6. Acide D,L-lactique

6.1.7. Dihydrogénophosphate de sodium

6.1.8. Gluconate de sodium

6.1.9. Chlorate de sodium

6.1.10. Acide dipicolinique

6.1.11. Bromure de céthyl-triméthyl-ammonium

6.1.12. Acétonitrile pour CLHP

6.1.13. Eau pure désionisée, ultrafiltrée

6.1.14. Hydroxyde de sodium.

6.2.      Solutions

6.2.1.     Solution mère d'étalonnage

Solution dans l'eau pure (6.1.13) des différents acides à doser (6.1.1 à 6.1.6)  à des concentrations exactement connues comprises entre 800 et 1200 mg l-1

Solution à conserver à +5° C pendant 1 mois maximum.

6.2.2.     Solution d'étalon interne

Solution de chlorate de sodium (6.1.9) à  environ 2 g l-1  dans l'eau pure (6.1.13)

Solution à conserver à +5° C pendant 1 mois maximum

6.2.3.     Solution d'étalonnage à injecter

Dans une fiole jaugée de 50 ml de classe "A", déposer à l'aide de pipettes de classe "A":

2 ml de la Solution d'étalonnage (6.2.1) 

1 ml de solution d'étalon interne (6.2.2)

Compléter à 50 ml avec de l'eau pure (6.1.13)

Homogénéiser par agitation

Solution à préparer chaque jour

6.2.4.     Solutions d'hydroxyde de sodium

6.2.4.1.   Solution d'hydroxyde de sodium M

Placer dans une fiole de 100 ml 4 g d'hydroxyde de sodium (6.1.14)

Compléter avec de l'eau pure (6.1.13)

Agiter jusqu'à dissolution complète.

6.2.4.2.   Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M

Placer dans une fiole de 100 ml 10 ml d'hydroxyde de sodium M (6.2.4.1)

Compléter avec de l'eau pure (6.1.13)

Homogénéiser.

6.2.5.     Tampon électrophorétique

Dans une fiole jaugée de 200 ml de classe "A", déposer

0.668 g d'acide dipicolinique (6.1.10)

0.364 g de bromure de céthyl-triméthyl-ammonium (6.1.11)

20 ml d'acétonitrile (6.1.12)

160 ml environ d'eau pure (6.1.13)

Agiter jusqu'à complète dissolution (si besoin  placer dans un bain à ultrasons pour éliminer les agrégats)

Amener à pH 5.64 avec tout d'abord de la solution d'hydroxyde de sodium  M (6.2.4.1) puis avec de la solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M (6.2.4.2)

Compléter à 200 ml avec de l'eau pure (6.1.13)

Homogénéiser par agitation

Solution à préparer chaque mois.

Conservation à la température du laboratoire.

7.      APPAREILLAGE

Un équipement d'électrophorèse capillaire nécessaire pour ces dosages contient essentiellement :

  • Un passeur d'échantillons
  • Deux flacons (vials) contenant du tampon
  • Un capillaire de silice non revêtue de 50 µm de diamètre interne et de 60 cm de longueur entre l'entrée du capillaire et la cellule de détection. De 7 à 15 cm, suivant les appareils, supplémentaires sont nécessaires pour que la sortie du capillaire soit immergée au centre d'un autre flacon
  •  Une alimentation haute tension de courant continu capable de délivrer des tensions de 30 à + 30 kv. Les électrodes immergées dans les deux flacons où débouchent les extrémités du capillaire sont reliées aux bornes du générateur
  • Un système de pressurisation capable de faire circuler le tampon dans le capillaire et permettre l'injection de la prise d'essai
  • Un détecteur UV
  • Un système d'acquisition des données

8.      Préparation des échantillons pour essai

8.1.      Dégazage et filtration

Les échantillons riches en gaz carbonique sont dégazés pendant 2 mn aux ultrasons. Les échantillons troubles sont filtrés sur une membrane dont le diamètre des pores moyen est de 0,45 µm.

8.2.      Dilution et ajout d'étalon interne

Placer 2 ml d'échantillon dans une fiole jaugée de 50 ml

Ajouter 1 ml de solution d'étalon interne (6.2.2).

Compléter à 50 ml avec de l'eau pure (6.1.13)

Homogénéiser.

9.      MODE OPERATOIRE

9.1.      Conditionnement  d’un capillaire neuf

  • Circulation d'eau pure (6.1.13) en sens inverse (de la sortie du capillaire vers le flacon d'entrée) pendant 5 mn avec une pression de 40 psi environ (2,76 bar ou 276 kPa)
  • Circulation d'hydroxyde de sodium 0,1 M (6.2.4.2) en sens inverse pendant 5 mn à la même pression
  • Circulation d'eau pure (6.1.13) en sens inverse (de la sortie du capillaire vers le flacon d'entrée) pendant 5 mn à la même pression
  •  Recommencer ce cycle : passages d'eau pure, d'hydroxyde de sodium 0,1 M, eau pure
  •  Circulation du tampon électrophorétique (6.2.5) en sens inverse pendant 10 mn.

9.2.      Reconditionnement d’un capillaire en cours d’utilisation

Lorsque que la qualité des séparations devient insuffisante un nouveau conditionnement du capillaire s'impose. Si les résultats obtenus ne sont toujours pas satisfaisants, changer le capillaire et le  conditionner.

9.3.      Vérification de la qualité du capillaire

Analyser à 5 reprises la solution d'étalonnage (6.2.3) dans les conditions d'analyses préconisées.

9.4.      Conditions de séparation et de détection

  • Allumage de la lampe du détecteur 1 heure avant le début des analyses
  • Rinçage du capillaire par circulation du tampon électrophorétique (6.2.5)  pendant 3 mn en sens inverse sous une pression de 40 psi
  • Injection par pression à 0,5 psi pendant 6 à 15 secondes des échantillons préparés en 8.1
  • La polarité est réglée afin que l'anode soit du côté du détecteur
  • Appliquer une tension de 0 à 16 Kv en 1 mn puis de 16 Kv  pendant 18 mn environ (la durée de la séparation peut légèrement varier en fonction de la qualité du capillaire )
  • La température est maintenue à + 25 °C
  • La détection dans l'ultra violet est faite à 254 nm
  • Rinçage du capillaire par circulation du tampon électrophorétique (6.2.5) pendant 2 mn en sens inverse sous une pression de 40 psi
  • Changer le du tampon électrophorétique (6.2.5)  contenu dans flacons d'entrée et de sortie tous les 6 injections au minimum.

9.5.      Ordre dans lequel les analyses doivent être effectuées

  • Changer le tampon électrophorétique (6.2.5)  à chaque nouvelle série d'analyses

La séquence des analyses contient dans l'ordre :

  • Analyse de la solution d'étalonnage (6.2.3)
  • Analyse du matériau de référence (échantillon externe de concentration connue pour les différents acides à doser)
  •  Analyse des échantillons préparés en 8.2.
  • A la fin des analyses effectuer un rinçage à l'eau pure (6.1.13) de 10 mn en sens inverse, (de la sortie du capillaire vers l'entrée),
  • Eteindre la lampe du détecteur.

10.    CALCULS DES RESULTATS

Les calculs sont faits à partir des surfaces des pics obtenues après intégrations.

Les surfaces des pics de solutés de la solution d'étalonnage (6.2.3) sont corrigées en tenant compte des variations de surfaces des pics de l'étalon interne. Le coefficient de réponse pour chaque acide est calculé.

Les surfaces des pics de l'étalon interne et des pics des solutés sont relevées pour chaque échantillon. Les surfaces des solutés à doser sont recalculées en  tenant compte de nouveau des variations de surfaces des pics de l'étalon interne pour obtenir des surfaces dites "corrigées".

Les surfaces corrigées sont ensuite multipliées par la valeur du coefficient de réponse correspondant.

FORMULE DE CALCULS

Les abréviations utilisées pour le calcul de la concentration d'un acide sont données dans le tableau suivant:

Les surfaces sont exprimées par les nombres entiers d'unités d'intégration.

Les concentrations sont données en g / l. (ne conserver que deux décimales).

ABREVIATIONS

 

SOLUTION DE REFERENCE

ECHANTILLON

SURFACES DU PIC DE L'ACIDE DOSE

SAR

SAE

PICS D'ETALON INTERNE

 

SEIR

SEIE

CONCENTRATION DE L'ACIDE DOSE

CAR

CE

La formule de calcul est:

Chaque fois que cela est possible, l'analyse en double exemplaire permet de mettre en évidence une erreur éventuelle dans la reconnaissance des pics ou une imprécision des intégrations. Le passeur d'échantillons permet de réaliser les analyses en mode automatique tout au long du jour et de la nuit.

11.    FIDELITE

11.1. Organisation des essais

Afin d'obtenir une validation interlaboratoires, des échantillons ont été confiés à 5 laboratoires. Chaque laboratoire a analysé en doubles exemplaires 16 échantillons. Ces échantillons comprenaient 2 vins blancs secs, 2 vins blancs liquoreux, 2 vins rosés et 2 vins rouges. Chaque vin  était présenté de façon anonyme ainsi que son double, le tout dans un ordre tiré au hasard.

11.2. Mesure de la fidélité


12.    ANNEXES

 

 

ELECTROPHOREGRAMME  D'UNE SOLUTION ETALON D'ACIDES

ELECTROPHEROGRAMME D'UN VIN

Une image contenant texte, diagramme, ligne, Tracé Le contenu généré par l’IA peut être incorrect.

13.    BIBLIOGRAPHIE

  1. ARELLANO  M., COUDERC  F. et PUIG .L  (  1997 ) : Simultaneous separation of organic and inorganic acids by capillary zone electrophoresis. Application to wines and fruit juices. Am. J. Enol. Vitic., 48, 408-412.
  2. KANDL  T. et KUPINA  S. ( 1999 ): An improved capillary electrophoresis procedure for the determination of organics acids in grape juices and wine. Am. J. Vitic., 50, 155-161.
  3. KLAMPF C.F. ( 1999 ): Analysis of organics acids and inorganics anions in different types of beer using capillary zone electrophoresis. J. Agric. Food Chem., 47, 987-990.